Saanud Pisa ülikoolilt esimese matemaatiku ametikoha, asus ta elama Firenze lähedale Arcetri linnakesse, lootes võimsa Toscana hertsogi kaitse all jätkata oma uurimusi, mille tulemused kippusid kiriku kanoniseeritud õpetusega üha enam vastuollu minema. 1612. a. sooritas ta hulga katseid süütul teemal, võrdlemaks õhu ja vee tihedust. Tema tulemus 1 : 400 (= 0,00250) on võrreldes praegusega 1 : 773 (= 0,0013, normaaltingimustel) küll ebatäpne, kuid oluliselt täpsem kui tema kaasaegsetel. Marin Mersenne andis väärtused 1 : 225 ja 1 : 1870, René Descartes 1 : 145, Firenze akadeemikud 1 : 1438. Oluliselt täpsema tulemuse sai alles poole sajandi pärast R. Boyle (1 : 938 = 0,00107), kasutades küllalt häid pneumaatilisi pumpasid.

Galilei enese jaoks oli hoopis olulisem Koperniku heliotsentrilise süsteemi kaitsmine ja põhjendamine. Juba 1597. a. kirjutas ta: „Koperniku seisukohtadele jõudsin ma juba aastate eest ning nendele toetudes leidsin seletuse mitmele loodusnähtusele, mis pole kaugeltki nii mõistetavad tavaliste hüpoteeside alusel. Kirjutasin hulga kaalutlusi vastaspoole põhjenduste vastu, kuid ei julgenud neid avaldada…“ Ta täpsustas ja täiendas pidevalt oma seisukohti uurimustega mehaanikast ja astronoomiast ning ootas soodsat võimalust nende avaldamiseks. Nähtavasti kõige tugevamateks uuteks argumentideks olid Linnutee tähtede ja Jupiteri kaaslaste avastamine. Omamoodi manifestiks kujunes Galilei kiri 21. detsembrist 1613, adressaadiks ta õpilane Benedetto Castelli (1578–1643), milles ta mõistis teravalt hukka katsed kasutada pühakirja teadusliku vaidluse argumendina. Seda kirja kirjutati ümber, seda uurisid Galilei mõttekaaslased ja vaenlased. 1615. a. saadeti kirja koopia koos kriitiliste kommentaaridega Rooma Pühale Ametile. Aasta lõpul sõitis Galilei ka ise Rooma. Nimelt kavatses Püha Amet anda hinnangu Koperniku süsteemile. Galilei lootis kaitsta heliotsentrilist süsteemi, kuid tema tõendused ei mõjunud, need pigem suurendasid Püha Ameti liikmete ohutunnet. 5. märtsil 1616. a. pandigi Koperniku peateos „De revolutionibus“ keelu alla ja õpetus liikuvast Maast tunnistati pühakirjavastaseks.

Galileid esialgu ei ähvardatud, kuid loomulikult ei saanud ta enam avalikult propageerida heliotsentrilist süsteemi. Ometi polnud tal keelatud kritiseerida Ptolemaiost, Aristotelest ja skolastilist teadust ning arendada süstemaatilistele vaatlustele ja katsetele toetuvat teaduslikku mõtlemisstiili. Katsete metoodikas pidas Galilei oluliseks kõrvaldada uuritava probleemi lahendamist segavate lisategurite mõju. Nii kasutas Galilei vaba langemise uurimisel ühesuguse kuju ja suurusega kehi. Hiljem täiustas ta katsekorraldust, kasutades kaldpinda ja pendlit, ning uuris seoseid kiiruse ja aja, samuti teepikkuse ja aja vahel.

14 aastat pärast Koperniku süsteemi keelu alla panemist lõpetas Galilei oma tähtsaima töö „Dialogo di Galileo Galilei … sopra i due massimi sistemi del mondo Tolemaico e Copernicano“ („Dialoog kahest peamisest, Ptolemaiose ja Koperniku maailmasüsteemist“) ja viis Rooma, et saada luba selle avaldamiseks. Uus paavst Urban VIII oli juba kardinalina (Maffeo Barberini) Galileisse hästi suhtunud. Töö lubati avaldada, kui autor eessõnas märgib, et Koperniku töö on vaid hüpotees. Sellise eessõna Galilei kirjutaski ja 1632. a. traktaat ilmus. Töö ise koosneb neljast dialoogist, iga dialoog toimub ühe päeva jooksul ning selles osalevad kolm tegelast: Galilei lähedane sõber, võib-olla ka õpilane, Firenzest pärit Filippo Salviati (1582–1614), veneetslane Giovanni Francesco Sagredo (1571–1620), samuti Galilei sõber, ja Simplicio (lihtsameelne), väljamõeldud isik, peripateetikute (Aristotelese) filosoofia kaitsja. Salviati esitab Galilei enese vaateid, Sagredo on aga haritud terve mõistusega mees, kes peab tegema valiku kahe seisukoha vahel.

1. päev. Teemaks on õpetus taevase maailma muutumatusest. Salviati arvates osutavad uued tähed ja Päikese plekid taevase maailma muutlikkusele. Simplicio pareerib, väites, et Päikese plekke põhjustavad Päikese ümbruses asuvad läbipaistmatud kehad (pilved). Salviati selgitab, et Kuu mäed ja orud näitavad, et Kuu ja teised taevakehad sarnanevad oma ehituselt Maaga. Simplicio seletab varjusid Kuu peal hoopis Kuu eri osade erineva heledusega.

2. päev. Teemaks on Maa liikumine. Siin formuleeris Galilei dünaamika kaks põhiprintsiipi: inertsiprintsiibi ja klassikalise relatiivsusprintsiibi.

Inertsiprintsiibi põhjendamisel kasutas Galilei matemaatikast tuttavat vastuväitelist tõestusmeetodit. Tasandi kalle horisondi suhtes on kiireneva liikumise põhjus, kui keha liigub alla, või aeglustumise põhjus, kui keha liigub üles. Keha liikumisel horisontaaltasandil ei ole põhjust ei kiirenemiseks ega aeglustumiseks. Seega liiguks keha ühtlaselt. Inertsiseaduse üldisem formuleering seostatakse harilikult René Descartes’iga („Principia philosophiae“, 1644).

Relatiivsusprintsiip on suunatud paigalseisva Maa ideoloogide vastu, kes rõhutasid, et tulistamisel ei sõltu laskekaugus sellest, kas tulistatakse ida või lääne suunas, ka langevad rasked kehad vertikaalselt, mitte kaldu jne. Galilei tõi juba tuttava näite liikuvast laevast ja resümeeris: laeval toimuvate nähtuste jälgimisega ei ole võimalik kindlaks teha, kas laev seisab paigal või liigub ühtlaselt. Siit jõuab lihtsasti ka tänapäevase tõlgenduseni: kuna üleminekuid ühest inertsiaalsüsteemist teise kirjeldavad Galilei teisendusvalemid, siis väidab relatiivsusprintsiip mehaanika seaduste invariantsust Galilei teisendustel.

3. päev. Teemaks on astronoomilised faktid: 1604. a. noova, planeetide vaatlused, eriti Veenuse faaside ja Jupiteri kaaslaste jälgimine ning ka Päikese plekid. Arutluste eesmärgiks on näidata Aristotelese õpetuse vastuolu vaatlusandmetega ja rõhutada heliotsentrilise süsteemi võimalikkust nii geomeetriliste kui ka dünaamiliste argumentide abil.

4. päev. Teemaks on looded (tõusud ja mõõnad), mida Galilei ekslikult seostas Maa liikumisega, pidades silmas analoogiat Veneetsiasse magedat vett vedava laevaga, kus laeva ebaühtlasel liikumisel hakkab laeva mahutites vesi liikuma kiirendusele vastassuunas. Ebaühtlusi Maa liikumises seostas Galilei ööpäevase ja aastase liikumise liitumisega. Sel ajal oli Galileil teada ka Kepleri idee seletada loodeid Kuu ja Päikese külgetõmbega, kuid ta pidas seda arvamust kergekaaluliseks, nähes selles püüet omistada taevakehadele teatud okultistlikke jõude.

Tuleb rõhutada, et Galilei „Dialoogid…“ pole mitte niivõrd traktaat füüsikast ja astronoomiast, kuivõrd metodoloogiline ja pedagoogiline töö, mis oli suunatud kanoniseeritud Aristotelese vastu ning püüdis kallutada mõtlevaid päid Koperniku õpetusele toetuva maailmakäsituse poole. Selle eesmärgi Galilei saavutas, kuid ränga hinnaga. Püha Amet alustas juurdlust, Galilei kutsuti Rooma. Ta oli 67-aastane ja haige ning palus arutluse edasi lükata. Vastuseks palvele oli uus kutse, mis ähvardas sunniviisilise aheldatud kohaletoomisega. Veebruaris 1633 viidi Galilei kanderaamil Rooma. Protsess kestis üle kahe kuu (12.04. – 21.06.1633). 22. juunil pidi ta inkvisitsiooni koostatud tekstiga lahti ütlema oma ketserlikest vaadetest. Kohtus jälgis Galilei hoolikalt juba varem omaks võetud joont: ta pole rikkunud 1616. a. keeldu, vaid analüüsis „Dialoogides…“ „heliotsentrilist süsteemi kui ühte võimalikku hüpoteesi“. Tänu sellele ei saanud inkvisitsioon esitada süüdistust ketserluses, mis võinuks viia tuleriidale, vaid pidi oma otsuses piirduma pehmema formuleeringuga: Galilei on „tugevasti kahtlustatav ketserluses“.